Mise en œuvre d’une analyse rapide et précise de glycanes marqués par 2-AB en recherche clinique

Aucun compromis au niveau de la précision ou de l’efficacité d’analyse n’est acceptable pour un chercheur en quête du prochain agent biothérapeutique prometteur ou chargé du développement d’un composé biosimilaire fiable. Chaque jour, de nombreux défis sont à relever par les professionnels des laboratoires de recherche clinique, comme réduire le temps de développement des procédés, réaliser rapidement des changements de modes opératoires ou réduire au minimum la variabilité des analyses.

L’étude de la glycosylation d’une protéine peut révéler des informations potentiellement très précieuses. Au cours de ces études de glycosylation de protéine, l’approche la plus courante pour la caractérisation des glycanes est l’analyse des glycanes libérés de manière enzymatique ou chimique de ladite protéine.

L’approche analytique repose sur le marquage des glycanes avec une molécule fluorescente, suivi d’une analyse par chromatographie liquide haute performance et une détection par fluorescence (HPLC-FD). Parmi les molécules fluorescentes qui peuvent être utilisées pour le marquage des glucides, le 2-aminobenzamide (2-AB) est la molécule la plus fréquemment utilisée lorsque l’HPLC est choisie comme technique de séparation. Il existe un grand nombre de types différents d’analyses qui peuvent être effectuées sur des glycanes marqués, mais la chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC) et la chromatographie d’échange d’anions (AEX) sont les plus fréquemment utilisées.

Optimisation de l’efficacité des procédures de travail pour l’analyse de glycanes marqués 2-AB

Trois défis distincts peuvent empêcher une analyse fiable de glycanes marqués 2-AB. Il s’agit de la présence de plusieurs fournisseurs, les limitations des instruments, et la difficulté à obtenir des résultats reproductibles. Ces défis peuvent être surmontés par l’utilisation du processus AdvanceBio glycan mapping d’Agilent, comprenant tout ce qui est nécessaire pour la préparation de glycanes marqués 2-AB à partir de glycoprotéines. Les glycanes clivés et marqués sont ensuite analysés à l’aide de colonnes d’UHPLC/HPLC pour une analyse ultra rapide en moins de 10 minutes.

L’absence de certaines informations aux étapes précoces du développement peut entrainer des contretemps importants en aval. Une incohérence peut aboutir à une modification de la glycosylation, ce qui peut avoir un effet négatif sur l’immunogénicité. Afin de garantir des résultats cohérents, des étalons de glycanes doivent être utilisés pour les tests de performance et la cartographie de rétention. Les étalons de référence permettent de s’assurer que les données essentielles ont bien été enregistrées et que chaque composant des processus fonctionne de manière optimale.

Afin de garantir une précision et une efficacité élevées pour les séparations des composés biopharmaceutiques complexes, il faut cliver les N-glycosylés et les isoler du mélange réactionnel puis les modifier avec un marqueur 2-AB avant traitement final et mise en forme pour l’analyse par LC. Les kits de préparation d’échantillons de glycanes AdvanceBio fournissent l’ensemble des réactifs nécessaires à la préparation des échantillons, ainsi qu’une documentation complète reprenant des conseils, des trucs et des astuces pour optimiser les préparations. Les colonnes AdvanceBio glycan mapping offrent de bonnes performances de vitesse et de résolution. Elles peuvent être utilisées avec des instruments de chromatographie liquide à une pression de 400 à 1 200 bars afin d’identifier et de quantifier de manière précise les glycanes marqués 2-AB.

Mise en œuvre des séparations par chromatographie d’interaction hydrophile ou d’échange d’anions faibles

Le profil de glycosylation de glycoprotéines thérapeutiques recombinées est un paramètre important qui peut avoir un effet sur la qualité des glycoprotéines produites. Comme le modèle de glycosylation qui peut être analysé par HILIC, le profil de charge des glycanes peut être analysé par chromatographie d’échange d’anions. Le profil de charge des N-glycanes peut révéler que la distribution des N-glycanes contient un certain nombre de sucres anioniques différents, qui peuvent comprendre une gamme de structures de glycanes. Les charges des glycanes sont de manière générale dues à des acides sialiques, bien que dans de rares cas, ces charges puissent être dues à la phosphorylation ou à la sulfatation d’unités monosaccharides au sein de la structure du glycane. Comme le profil détaillé obtenu par HILIC, le profil de charge des glycanes est un paramètre important pour la surveillance des protéines biothérapeutiques. La combinaison de la HILIC et de la chromatographie d’échange d’anions faibles permet une séparation hautement orthogonale de glycanes marqués 2-AB.

Dans une étude, des N-glycanes de fétuine ont été clivés de manière enzymatique à partir des protéines, puis marqués par 2-aminobenzamide, puis purifiés à l’aide de cartouches de HILIC. Les profils de charge des glycanes ont été déterminés à l’aide d’une colonne de chromatographie d’échange d’anions forts Agilent Bio SAX, avec des pics bien résolus et une excellente précision.

Analyse bidimensionnelle complète par chromatographie liquide de N-glycanes complexes

Une caractérisation détaillée du profil des glycanes de composés biopharmaceutiques nécessite l’utilisation de technologies analytiques avancées développées pour une analyse efficace et hautement détaillée de la glycosylation. Une analyse bidimensionnelle par chromatographie liquide et multiples heart-cutting, combinant une chromatographie d’échange d’anions faibles et une séparation par HILIC, permet d’obtenir plus d’informations à partir d’une seule analyse.

L’érythropoïétine (EPO) est une hormone glycoprotéinique qui régule la production des globules rouges. La glycosylation de l’EPO est extrêmement variable car l’EPO contient de multiples sites de glycosylation, chacun de ceux-ci permettant d’obtenir une grande variété de structures de glycanes. Bien que les colonnes HILIC actuelles présentent un pouvoir de résolution supérieur pour les glycanes, le mélange de glycanes pouvant être obtenu avec l’EPO thérapeutique est tellement compliqué qu’une résolution complète est impossible avec une séparation HILIC à une dimension. Une chromatographie liquide bidimensionnelle complète en continu, combinant une HILIC dans une première dimension et une séparation hautement orthogonale par chromatographie d’échange d’anions faibles dans une seconde dimension, permettent d’obtenir une haute résolution et des performances en termes de capacité de pics. L’automatisation complète de l’analyse bidimensionnelle permet de raccourcir le temps d’analyse à 110 minutes par comparaison avec un temps d’analyse beaucoup plus long pour une analyse en discontinu.

La gamme d’options analytiques pour la détermination de glycanes marqués 2-AB permet aujourd’hui, pour la recherche clinique, d’obtenir des résultats reproductibles et fiables plus vite que jamais.

Utilisation en recherche uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.

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