Быстрый и точный анализ 2-AB-меченых гликанов в клинических исследованиях

В погоне за открытием нового перспективного биотерапевтического средства или разработкой надежного биоаналога нельзя допускать ухудшения аналитической точности и эффективности. Необходимость ускорения разработки методик, быстрое внесение изменений в методики и уменьшение отклонений в анализе — лишь некоторые из задач, с которыми специалисты клинических исследовательских лабораторий сталкиваются ежедневно.

При изучении гликозилирования белков можно получить крайне важные сведения. В исследованиях гликозилирования самым распространенным способом характеристики гликанов является анализ гликанов, высвобожденных из белков ферментативным или химическим путем.

Аналитический подход основан на присоединении к гликанам флуоресцентной молекулы в качестве метки с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием (ВЭЖХ-ФД). Если для разделения используется методика ВЭЖХ, то в качестве флуоресцентных молекул для маркировки углеводов чаще всего используется 2-аминобензамид (2-AB). Анализ меченых гликанов может выполняться различными методами. Наиболее распространенными из них являются хроматография гидрофильных взаимодействий (HILIC) и анионообменная хроматография.

 Повышение эффективности процесса анализа 2-AB-меченых гликанов

На пути надежного анализа 2-AB-меченых гликанов существует три основных препятствия. А именно — необходимость закупки материалов у нескольких поставщиков, ограниченные возможности оборудования и сложность получения воспроизводимых результатов. Эти препятствия можно преодолеть с помощью рабочего процесса картирования гликанов AdvanceBio компании Agilent, который включает в себя все необходимое для получения 2-AB-меченых гликанов из гликопротеинов. После этого высвобожденные и меченые гликаны анализируют с помощью колонок для УВЭЖХ/ВЭЖХ, что позволяет добиться крайне высокой скорости анализа гликанов — менее 10 минут.

Если на ранних стадиях исследования отсутствуют какие-либо сведения, это может привести к серьезным проблемам позднее. Несогласованные результаты могут привести к гликозилированию, что отрицательно сказывается на иммуногенности. Чтобы добиться согласованных результатов, для испытаний характеристик и поведения и картирования на основе времен удерживания следует использовать стандарты гликанов. Контрольные стандарты позволяют убедиться в получении необходимых данных и оптимальном использовании каждого компонента рабочего процесса.

Чтобы гарантировать максимальную точность и эффективность при сложных разделениях биопрепаратов, N-связанные гликаны необходимо высвободить и выделить из реакционной смеси, а перед окончательной очисткой и подготовкой к ЖХ-анализу их необходимо пометить молекулами 2-AB. Наборы AdvanceBio для пробоподготовки гликанов включают все реагенты, необходимые для подготовки проб, и сопровождаются документацией с объяснениями, советами и подсказками по оптимизации. Колонки для картирования гликанов AdvanceBio гарантируют высокие показатели скорости и разрешения. Их можно использовать для точной идентификации и количественного анализа 2-AB-меченых гликанов в системах ЖХ при давлении от 400 до 1200 бар.

Разделение с помощью хроматографии гидрофильных взаимодействий или анионообменной хроматографии со слабым анионообменным сорбентом

Профиль гликозилирования рекомбинантных терапевтических гликопротеинов является важным параметром, влияющим на качество полученных гликопротеинов. Процесс гликозилирования можно анализировать с помощью хроматографии гидрофильных взаимодействий, а профиль различных заряженных форм гликанов можно анализировать, используя анионообменную хроматографию. Профиль заряженных форм N-гликанов помогает выявить распределение N-гликанов с различным содержанием анионных сахаров, которые могут включать целый ряд гликановых структур. Обычно заряженные формы гликанов образуются из-за сиаловых кислот, но в редких случаях это может быть результатом фосфорилирования или сульфатирования моносахаридных фрагментов в структуре гликанов. Дополняя детальное профилирование, предоставляемое хроматографией гидрофильных взаимодействий, профилирование заряженных форм гликанов также является важным параметром контроля биотерапевтических белков. Комбинация методов хроматографии гидрофильных взаимодействий и анионообменной хроматографии со слабым анионообменным сорбентом позволяет добиться высокой ортогональности разделения 2-AB-меченых гликанов.

В одном исследовании N-гликаны фетуина высвободили из белков с помощью ферментативного расщепления, a затем, после очистки с помощью патронов для хроматографии гидрофильных взаимодействий, пометили с помощью 2-аминобензамида. Профиль заряженных форм гликанов, установленный с помощью колонок Agilent Bio SAX, продемонстрировал высокое разрешение пиков и непревзойденную воспроизводимость результатов.

Полная двумерная жидкостная хроматография сложных N-гликанов

Для подробного описания профиля гликанов в биопрепаратах необходимы продвинутые аналитические технологии. Теперь они доступны и позволяют добиться эффективного и крайне детального анализа гликозилирования. Анализ с помощью двумерной ЖХ с многократным переносом участков пиков, сочетающий разделение методами анионообменной хроматографии со слабым анионообменным сорбентом и хроматографии гидрофильных взаимодействий позволяет получить больше сведений за один цикл анализа.

Эритропоэтин (ЭПО) представляет собой гликопротеиновый гормон, регулирующий выработку красных кровяных телец. Гликозилирование ЭПО может быть крайне разнообразным, поскольку он содержит множество сайтов гликозилирования, каждый из которых может нести самые разнообразные гликановые структуры. Хотя имеющиеся на данный момент колонки для HILIC имеют высокую разрешающую способность в отношении гликанов, смесь гликанов в терапевтическом ЭПО настолько сложная, что одномерное разделение с помощью хроматографии гидрофильных взаимодействий не позволяет добиться полного разрешения. Совместное использование всесторонней двумерной ЖХ с хроматографией гидрофильных взаимодействий  в качестве первого этапа, а затем характеризуемым высокой степенью ортогональности разделением с помощью анионообменной хроматографии со слабым анионообменным сорбентом в качестве второго этапа обеспечивает высокое разрешение и пиковую плотность. Полностью автоматизированный двумерный анализ занимает всего 110 минут, что намного быстрее анализа с помощью раздельных этапов.

Благодаря существованию различных вариантов анализа 2-AB-меченых гликанов исследователи могут получать воспроизводимые и надежные результаты с непревзойденной скоростью.

Только для исследовательских целей. Не для использования в диагностических процедурах.

1. J. E. Schiel, J. Au, Hua-Jun He, K. W. Phinney. LC-MS/MS biopharmaceutical glycoanalysis: identification of desirable reference material characteristics. (Анализ гликозилирования биопрепаратов методом ЖХ-МС-МС: определение требуемых характеристик веществ сравнения) Anal. Bioanal. Chem. 2012, 403, 2279–2289 and T. Song, S. Ozcan, A. Becker, C. B. Lebrilla. In-Depth Method for the Characterization of Glycosylation in Manufactured Recombinant Monoclonal Antibody Drugs. (Всесторонний метод характеристики гликозилирования в производимых лекарственных средствах на основе рекомбинантных моноклональных антител ) Anal. Chem. 2014, 86, 5661–5666.

Поделиться