Лучший выбор колонок для достоверного картирования пептидов

Картирование пептидов, впервые описанное в начале 1990-х годов, стало ключевой техникой во многих областях исследования и анализа белков. Изначально бывшее частью «революции протеомики», как сейчас называют первые попытки гидролиза белков до олигопептидов с целью их идентификации с помощью масс-спектрометрии, картирование пептидов до сих пор используется для получения начальной информации о структуре белка.

И что особенно важно, в последние годы его применяют все чаще и чаще. Сегодня от картирования протеинов зависят клинические исследования, производство и контроль качества. В промышленности картирование используется не только для подтверждения последовательности аминокислот произведенного белка, но и для того, чтобы убедиться, что оригинальная последовательность не претерпела никаких изменений, таких как замена отдельных аминокислот или посттрансляционные модификации (ПТМ). Кроме того, картирование используется для подтверждения идентичности различных партий во время клинических исследований и разработки биопроцессов, а так же для мониторинга генетической стабильности рекомбинантных клеточных линий. При разработке биоаналогов эту технику используют для сравнения результатов работы с оригинальным препаратом.

Влияние инноваций на ход работы

Схема показывает типичные этапы процесса картирования протеинов. Хотя основные шаги ничуть не изменились с момента появления картирования, инновации на каждом этапе позволили значительно улучшить эту технику. К настоящему времени картирование превратилось в автоматизированную рутинную процедуру.

Типичный ход процесса картирования пептидов

В данном процессе используются два метода детектирования пептидов. Для подтверждения последовательности известного белка можно сравнить найденные пептиды с контрольным образцом с помощью УФ-детектора. Это хороший метод, если вы уверены в своем хроматографе и у вас есть контрольный образец для сравнения.
Но для идентификации и исследования ПТМ неизвестных белков необходим масс-спектрометр. С его помощью можно определить точные молекулярные массы пептидов. Затем эти идентифицированные пептиды можно с помощью специализированного ПО сравнить с базой данных молекулярных масс известных пептидов, и определить как сами эти пептиды, так и начальный белок.

Компания Agilent занимает лидирующую позицию в картировании пептидов, предлагая решения для подготовки проб и ВЭЖХ-разделения, программно-информационные комплексы и ВЭЖХ-колонки и привитые фазы

Однако все еще есть нерешенные задачи, особенно при выборе подходящей колонки, например для улучшенного разделения пептидов с ПТМ. Предлагаем вам некоторые рекомендации.

Общие факторы, которые следует принять во внимание при выборе колонки

Неизбежная сложность протеолизатов белковых смесей требует для разделения высокоэффективную колонку с высоким разрешением. На эффективность и разрешение колонки влияют несколько факторов:

• Эффективность разделения материала колонки. На эффективность разделения влияют размер пор и частиц, а так же строение частиц (целиком пористые или поверхностно-пористые). Идеальная колонка должна давать разделение, достаточное для достоверного картирования.

• Мобильная фаза должна подходить для используемой техники детектирования. Современные ВЭЖХ-МС методики, которые используют в качестве ион-парного реагента подходящую для МС муравьиную кислоту обеспечивают повышенную интенсивность сигнала по сравнению с другими модификаторами. При использовании УФ-детектора обычно применяется трифторуксусная кислота. Однако применение муравьиной кислоты приводит к расширению и размыванию пиков, а на многих С18 неподвижных фазах еще и к совместному элюированию пептидных пар. Идеальная колонка должна давать узкие пики при использовании муравьиной кислоты.

• Проба. В пробе после гидролиза присутствует широкий спектр пептидов, от гидрофильных до гидрофобных, возможно также наличие длинных полипептидов. Идеальная колонка должна давать хорошие результаты при анализе химически различных пептидов.

• Размеры колонки. Для сложных карт необходимы более длинные колонки, а чувствительность масс-спектрометрии зависит от диаметра колонки. Необходимы более длинные и тонкие колонки с не слишком высоким обратным давлением. Идеальная колонка должна соответствовать этим требованиям.

Доказанно лучший выбор

Возникли вопросы по выбору колонки для картирования пептидов? Эксперты Agilent всегда готовы помочь. Посмотрите запись нашего последнего вебинара «Выбор правильной колонки и подвижной фазы для картирования пептидов с помощью ВЭЖХ-МС» (‘Choosing the Correct Column and Mobile Phase for LC/MS Peptide Mapping’).

Кроме того, в нашем практическом руководстве вы можете найти детальные рекомендации экспертов. Практическое руководство можно скачать здесь.

Компания Agilent стремится считает разрабатывать высококлассные решения для всего процесса картирования пептидов. своим долгом.
Узнайте больше здесь.

Поделиться